MichaelJ.Loeffelholz1Yi-WeiTang2
摘要
21世纪初爆发的三次前所未有的人类冠状病*（HCoV）感染进一步突显了对现成、准确、快速的诊断检测方法的需求。随着创新测定方法的开发以及新兴检测方法的问世，在人类新型冠状病*感染的实验室诊断方法方面取得了显著的进步。新的实验室方法检测更快速，灵敏度和特异性更高，并且正在逐步取代常规的金标准。本文回顾了目前可用于检测冠状病*的实验室方法，侧重于武汉正在发生的新型冠状病*感染（COVID-19）。病*性肺炎通常不会产生脓性痰。因此，鼻咽拭子是一种通常用于获得检测样本的采集方法，但鼻咽样本可能会造成一些感染漏检；此时可能需要通过支气管镜检查来采集呼吸道更深处的样本。另外，由于随着时间推移，鼻咽中出现SARS-CoV-2的可能性增加，所以可以重复进行检测。目前正在开发几种集成、随机存取、床旁检测分子设备，可用于快速准确诊断SARS-CoV-2感染。此类测定方法简单、快速、安全，并且可以在负责检测医院和诊所使用。
关键词：人类新型冠状病*，SARS-CoV-2，COVID-19，POCT，实时PCR，血清学
引言
冠状病*属于冠状病*科，其包括4个属：α冠状病*、β-冠状病*、δ-冠状病*和γ-冠状病*，并且还包括几个亚属和种。在很多动物和人类中都发现了冠状病*。人类冠状病*（HCoV）包括α冠状病*属中的HCoV-E和HCoV-NL63，以及β-冠状病*属的A谱系（Embecovirus亚属）中的HCoV-OC43和HCoV-HKU1。人类冠状病*最初是在年代从上呼吸道感染患者的细胞培养物中分离出来，后来被称为HCoV-E和HCoV-OC43。HCoV-NL63和HCoV-HKU1是于年代初在细支气管炎和肺炎患者中发现的。年，来源于蝙蝠的β-冠状病*的B谱系冠状病*（Sarbecovirus亚属）在中国南部广东省从果子狸传播到人类，引起严重呼吸道疾病，并被命名为严重急性呼吸综合征冠状病*（SARS-CoV）。年，β-冠状病*的C谱系（Merbecovirus属）在沙特阿拉伯从骆驼传播到人类，引起了与SARS相似的临床综合征，被称为中东呼吸综合征冠状病*（MERS-CoV）。
年12月，在中国湖北省武汉市发现了一种人类新型冠状病*，被命名为SARS-CoV-2。基因组测序表明SARS-CoV-2与在蝙蝠中检测到的β-冠状病*密切相关，但不同于SARS-CoV。
实验室诊断
样本采集：必须认识到，无论实验室使用的检测方法多么快速、准确，都需要在适当的时间从患者体内正确采集样本才能确诊如SARS-CoV-2引起的病*性肺炎。已从上呼吸道和下呼吸道各个部位（包括咽喉、鼻咽、痰液和支气管液）检出地区性人类冠状病*。在中国的COVID-19暴发期间，口咽拭子的使用频率远高于鼻咽拭子。美国疾病预防控制中心（CDC）建议仅采集上呼吸道鼻咽（NP）拭子。口咽（OP）样本的采集优先级较低，并且如有采集，应将其与鼻咽拭子放在同一采集管中。于年3月16日访问）。应将拭子样本放置在通用或病*运送培养基中。鼻咽吸出物也是适合检测人类冠状病*的样本。
为了确保SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2检测的灵敏度最高，建议采集并检测上下呼吸道样本。但是，通过支气管镜检查采集痰液（尤其是BAL）会因产生气溶胶液滴而进一步增大医护人员生物安全风险。医护人员正确使用个人防护装备（PPE）非常重要。支气管镜检查是一项技术要求很高的操作，需要由训练有素的医务人员实施，并且在世界上很多地区都无能力提供。上呼吸道样本易于采集，因此在资源有限的情况下，这增加了对症状较轻患者进行检测的机会。从粪便、尿液和血液样本中也可以检出SARS-CoV和MERS-CoVRNA，但通常不如呼吸道样本可靠。SARS-CoVRNA是一种例外情况，可在症状发作后约2周持续在粪便中检出。为了在最高灵敏度条件下检出地区性人类冠状病*，应在症状发作的前几天内采集上呼吸道样本。MERS和SARS患者中的RNA脱落动态可能反映了样本来源、疾病严重程度和基础风险因素。在不需要呼吸机支持的住院患者中，上呼吸道的MERS-CoVRNA水平通常在症状发作后的第1周达到峰值。在需要通气的死亡病例中，下呼吸道样本中的RNA水平在第2周至第3周达到峰值。SARS-CoV出现了类似的脱落模式：在症状发作后7-10天，上呼吸道样本的RNA阳性率达到峰值，然后稳定下降；而在疾病发作后的3周内，下呼吸道样本的RNA阳性率仍然较高。在一项研究中，糖尿病与呼吸道中MERS-CoVRNA长时间脱落相关。
病*性肺炎通常不会产生脓性痰。因此，鼻咽拭子／冲洗液是通常用于获得检测样本的采集方法。鼻咽样本可能会造成早期感染漏检；这可能需要通过支气管镜检查来获得呼吸道更深处的样本。另外，由于随着时间推移，鼻咽中出现SARS-CoV-2的可能性增加，所以可以重复进行检测。在12例COVID-19患者中，有11例自我采集的唾液样本呈阳性，从而表明在用于SARS-CoV-2感染的诊断、监测和感染控制方面，这是一种前景不错的无创样本。在撰写本文时，关于上呼吸道和下呼吸道样本检出SARS-CoV-2的性能的数据很少。血清是可用于检测SARS-CoV-2的另一来源；但是，只有15％的肺炎住院患者血清中可检出RNA。应将采集的用于实验室检测人类冠状病*的样本冷藏保存，或者在-70℃或更低温度下冷冻保存。据报告，感染SARS-CoV-2的患者的直肠样本呈阳性。
生物安全注意事项：如果患者的旅行或接触史或症状表明可能感染了高风险的新型SARS-CoV或MERS-CoV，则应在生物安全3级（BSL-3）条件下初步处理样本，直至通过裂解或其他方法使样本或等份样本丧失感染性。在这一情况下，不应常规执行病*分离。
细胞培养：由于缺乏可用的细胞系、获得结果所需的时间较长、人力和专业知识要求较高，以及缺乏用于培养确认的市售抗血清，不会常规进行细胞培养物的人类冠状病*分离来进行诊断。SARS-CoV和MERS-CoV将在原代猴细胞和细胞系中生长，但是出于生物安全原因，不应对常规诊断实验室中的疑似病例进行细胞培养。但是，细胞培养物中的病*分离对于获得分离物以用于表征以及支持疫苗和治疗药物开发而言是至关重要的。
快速抗原检测：理论上讲，快速抗原检测的优势在于可以快速获得结果并且人类冠状病*的检测成本低，但是基于这一方法用于检测流感（Flu）病*的经验，其灵敏度较差。在病*滴度最高时，适当的样本采集时间可能会提高对人类冠状病*快速抗原检测的诊断灵敏度。
血清学：由于缺乏市售诊断试剂，更不用说已通过临床试验和监管审评流程审查的市售诊断试剂，不能常规使用血清学测定来诊断人类冠状病*感染（表2）。另一方面，血清学测定对于了解新出现的人类冠状病*的流行病学（包括无症状感染的负担和作用）非常重要。
在诊断新型和新出现的人类冠状病*病例时，抗体检测尤为重要。在此类情况下，感染的患者可能无法测出病*RNA阳性，尤其是在疾病的早期阶段，但可以回顾性证明已经产生了免疫反应。在鉴定SARS-CoV-2时，尤其是在快速抗原检测和／或分子测定不可用也不稳定的情况下，可将血清学用作辅助诊断工具。最近的一项研究表明，在发病5天后，在感染SARS-CoV-2的所有39名患者中均检出IgM和IgG抗体。在鼻咽拭子样本采集不当并且分子测定结果无法达到令人满意的程度时，可采用血清学测定方法来辅助诊断SARS-CoV-2感染。在中国，截至年3月12日，已有6种血清学测定设备获得了国家药品监督管理局（NMPA）的紧急批准（表3）。为了保持样本完整性和血清学检测的性能，适当的样本处理和贮存很重要。
分子方法：随机扩增深度测序方法在鉴定MERS-CoV和SARS-CoV-2中起着关键作用。对于临床诊断应用，人类冠状病*的遗传异质性排除了单个“泛HCoV”分子测定的需要（表2）。有些泛CoV测定使用了简并引物，有些使用了多个引物组，还有一些使用了单组的非简并引物。目前用于检测地区性人类冠状病*（HCoV-NL63、HCoV-HKU1、HCoV-OC43和HCoV-E）的分子呼吸道检测试剂盒需要多组PCR寡核苷酸。在分子呼吸道检测试剂盒中，适用范围包括对地区性人类冠状病*检测为阴性的SARS-CoV-2病例。
在中国，有11种分子设备获得了NMPA的紧急批准，其特性比较可参见表1。据报告，此类设备的性能各不相同。在注册证中，已清楚指明仅为SARS-CoV-2感染肺炎的辅助诊断及应急储备。需要在1年后延续注册时提供更多的多中心临床试验数据。其中一家公司（华大智造科技有限公司）使用其鼻咽拭子技术检测给定样本中的所有病原体，包括SARS-CoV-2，另一家公司（英诺特（唐山）生物技术有限公司）使用了恒温扩增后的芯片检测。其他9种设备是将实时PCR技术与水解探针结合在一起。在提取核酸（分离的试剂和系统）后，将提取物转移到实时PCR热循环仪（例如：ABIFastDx实时PCR仪）中进行核酸扩增和检测。
世界卫生组织在下列网站上发布了用于检测SARS-CoV-2RNA的几种RT-PCR方案：